Felipe el Hermoso y Juana la Loca vuelven a Castilla en 1505 para ocupar el puesto de los reyes de España después de recibir la noticia de la muerte de la reina Isabel. Esta vez utilizan el barco en lugar de atravesar el territorio francés, considerando arriesgado el viaje por territorio francés a la vista de la buena relación surgida entre el rey francés y Fernando por el enlace matrimonial con Germana de Foix.
El joven príncipe, heredero de la corona por ser el consorte de la princesa Juana, tenía la clara idea de eliminar a su suegro del cargo de regente, apoyándose en la nobleza castellana, partidaria de colocar a Felipe y a Juana como únicos reyes de España, en contra del testamento de la reina Isabel. En lugar de entrar por Laredo, continúa navegando hacia La Coruña para ganar tiempo, ya que se estaba preparando el terreno entre la nobleza para ganar popularidad y simpatía con el fin de ser coronado por la mayoría de los nobles castellanos. A través de la nobleza partidaria de Felipe se estaba convenciendo al resto de los grandes para terminar con la regencia de Fernando y establecer directamente la sucesión de la princesa Juana y Felipe.
Regencia y muerte de Fernando el Católico
Fernando, después de dos encuentros con Felipe sin ningún éxito, decide marchar a su tierra natal, Aragón y Nápoles. La hostilidad de la nobleza castellana tampoco permitió a Fernando permanecer en Castilla como regente a pesar del testamento de su mujer Isabel. Por suerte para el destino de España, ocurre algo inesperado el 25 de septiembre de 1506: Felipe muere en Burgos en medio de una fiesta debido a una enfermedad producida por ingerir alguna bebida, aunque no parece que fuese envenenado. Aparece la figura del cardenal Cisneros, que fue confesor de la reina Isabel y que tenía una posición fuerte dentro y fuera del mundo eclesiástico y de la alta nobleza. Los dos partidos, el fernandino, representado por el duque de Alba, la casa del Infantado y el condestable, y el antifernandino, a cuya cabeza se encontraban Nájera, Villena y Juan Manuel, confían en la persona de Cisneros para la regencia del reino y la situación se controla a pesar del desastre causado por la sequía y la peste que asolaban la población. La mitad de la población castellana pereció en aquellos años de 1506-1507.
A la vuelta de Nápoles, Fernando trae al Gran Capitán a España, otro personaje importante que había estado al lado de la reina Isabel y que se hizo famoso en Europa con los triunfos conseguidos durante las guerras de Nápoles contra el ejército francés. En el camino de vuelta se entrevista con Luis XII de Francia en Savona, cerca de Génova. Se respira tranquilidad entre los dos reyes que hasta hacía poco habían estado en guerra: era algo normal en la Edad Media tal cordialidad en la relación entre monarcas europeos. Fernández de Córdoba, el Gran Capitán, fue alabado por el rey francés ante Fernando por haber derrotado a su poderoso ejército en suelo italiano, a pesar del gran número de soldados franceses que habían perecido en la guerra. El reconocimiento por parte del enemigo francés demuestra hasta qué punto llegó el prestigio de Fernández de Córdoba como héroe militar. Fernando llegó a sentir envidia de su vasallo, tan reconocido y apreciado en el mundo militar europeo.
Los barcos que transportan el séquito de Fernando llegan a Valencia en lugar de a Barcelona, ya que a la ida había pasado por Aragón y Cataluña. El 11 de agosto de 1507 desembarca en el puerto de Valencia. Comienza la segunda regencia de Fernando como gobernador de Castilla, esta vez con el apoyo de la gran mayoría de la alta nobleza. Igual que antes, Fernando ejerce desinteresadamente y soluciona los problemas a los que Castilla se enfrentaba en aquel entonces. La anterior pacificación había sido más dificultosa porque la nobleza rebelde había estado apoyada por el ejército de Portugal, pero esta vez fue mucho más fácil. La cabeza del partido de la oposición fue Juan Manuel, que se marcha a Flandes y deja su puesto al duque de Nájera en el castillo de Burgos con una importante guarnición de soldados, pero este se ve obligado a rendirse ante el ataque de Pedro Navarro, mano derecha de Fernando, y entrega la mayor parte de las fortalezas, conservando la villa de Nájera, la capital. Otro importante personaje que figuraba en las filas del bando rebelde era el duque de Medinasidonia, que dominaba Andalucía, y que fue simplemente castigado después de presentar su sumisión y obediencia a Fernando.
Así se llevó a cabo la política de sometimiento de la nobleza rebelde que siempre había actuado en contra de Fernando desde que falleció su mujer Isabel, y sobre todo cuando volvió a casarse con la sobrina del rey francés, lo que ponía en riesgo la unidad de Castilla y Aragón en el caso de que naciera un hijo heredero de Fernando y le sucediera en el reino de Aragón. Uno de los logros destacados fue la incorporación de Navarra a la corona de Castilla, que podía haber sido para la de Aragón, ya que su padre había sido rey de Navarra y había motivos suficientes para ello. En 1444, a la muerte de la reina Blanca de Navarra, siendo Juan II de Aragón el rey consorte, surge el conflicto familiar entre el hijo heredero Carlos de Viana y su padre Juan II, con el resultado del enfrentamiento en la guerra civil. Los beaumonteses y los agramonteses luchan entre sí hasta que finalmente gana Juan II y nombra a su hermana Leonor princesa de Navarra, pero en 1479, al morir Juan II de Navarra, pasa a manos de la casa francesa de Foix. Las dinastías francesas de Champaña, de Évreux, de Foix y de Albret controlaban Navarra hasta que gracias a la diplomacia de Fernando, que recibe el apoyo del papa y de Inglaterra en contra de Francia, consigue incorporar Navarra a la corona de Castilla. Fernando tuvo que intervenir para sofocar el enfrentamiento armado entre el rey de Navarra, apoyado por Francia, y los rebeldes, que no querían formar parte de Francia.
En 1515 Fernando se corona rey de Navarra. Otra de las tareas pendientes era el despliegue por el norte de África para asegurar la paz en el Mediterráneo. Cisneros, junto con Pedro Navarro, será el encargado de conquistar Orán, Bujía, Argel y toda la costa africana hasta Trípoli, y ponerla bajo el control de España. Aunque más tarde se producirá el desastre de Gelves, donde el hijo del duque de Alba, García de Toledo, fallecerá. Después de la muerte de Fernando la hegemonía española en la zona se pierde por la aparición de Barbarroja, que recupera Bujía y Argel. El papa Julio II le obliga a concentrarse en los asuntos de Italia y Fernando tiene que retirar sus fuerzas de la costa africana. El 10 de diciembre de 1508 se firma la Liga de Cambray para recobrar las posiciones perdidas en Italia por España y Francia. En ese tratado participan también el emperador alemán Maximiliano I y el papa con la supuesta intención de formar una alianza contra los turcos, aunque en realidad el objetivo fundamental era el de repartirse Venecia. Esta Liga fue originalmente la consecuencia de la entrevista celebrada entre Fernando y Luis XII en junio de 1507 para poner fin a la guerra de Nápoles, con el resultado del triunfo de España.
Al final, Julio II firmó la paz con Venecia en contra de lo acordado por la Liga de Cambray. Ante tal movimiento, Francia empieza la guerra contra el pontífice apoyada por Venecia y por el emperador, mientras que Fernando se alinea con el Vaticano formando esta vez la segunda Liga Santa en 1511, dando lugar al comienzo de una nueva fase en la guerra de Italia. Además, Fernando funda la Universidad de Alcalá, aunque realmente fue Cisneros el promotor. En el camino de regreso a Castilla se produce el encuentro más esperado: padre e hija se ven en Tórtoles el 29 de agosto de 1507. Fernando en calidad de gobernador, y Juana la Loca como reina de Castilla. Fernando otorga a Cisneros el capelo cardenalicio y lo nombra cardenal de España e inquisidor general, además de arzobispo de Toledo: se creaba así la figura de un todopoderoso Cisneros en recompensa por haberse ganado la confianza de Fernando. Después de la muerte de este será nombrado gobernador del reino. En 1509 nace el primer hijo habido con Germana de Foix, pero muere a los pocos días, el 3 de mayo de 1509, provocando la incertidumbre por la posible separación de Castilla y Aragón.
En los últimos meses de 1515 sucedieron cosas que ya Fernando no pudo controlar, en particular los asuntos de Italia: el nuevo rey francés Francisco I entra en el ducado de Milán sin que pueda impedirlo. El 25 de enero de 1516 muere en un pueblo de Cáceres, Madrigalejo, en el camino a Guadalupe. Fernando es considerado el mejor rey en toda la historia de España por sus muchos méritos y contribuciones a lo largo de su reinado. Su propio bisnieto, Felipe II, hará este comentario sobre Fernando: